Een bedenkelijke glimlach

Je kan het niet geloven maar ik heb eindelijk het mysterie opgelost. Welk mysterie?

Wel al een tijdje geleden bekwam ik vreemde waardes tijdens mijn UV titraties. Mijn UV titraties zijn onderzoek naar bindingssterkte tussen gastheer (host) en gast (guest). En in een paar posts geleden (zie hier) legde ik kort en simpel uit hoe dit in zijn werk gaat maar natuurlijk vertelde ik niet alles. Meer er over straks.

Een UV Titratie is een spectrofotometrische techniek waarbij cuvet met het te onderzoeken staal in het toestel wordt geplaatst, een bepaalde golflengte van een lichtbron wordt doorgelaten en door het staal gestraald. Indien het staal goed absorbeert bij deze golflengte zal de lichtintensiteit (I) afnemen. Hieronder is een simpele weergave terug te vinden.

fig. 1 Schema

korte uitleg over schema:

- Source: (licht)bron

- Monochromator: bepaald 1 golflengte (van het Griekse mono = 1, chroma = kleur)

- Dispersion device: een prisma dat het licht breder opsplitst om gescheiden te worden

- Slit: zijn nodig om alleen de gekozen golflengte door te laten

- Sample: staal dat in een cuvet zit

- Detector: meestal een DAD (Diode-Array Detector) maar daar ga ik nu niet over beginnen. 

In mijn geval wordt er ook nog een blanco cuvet in het toestel geplaatst en wordt de straal gesplitst en tegelijkertijd door beide cuvetten gestuurd om zo de gemeten absorbantie van de blanco van het staal af te trekken. Wat zit er in de blanco, wel alles behalve het te onderzoeken staal zelf. Een voorbeeld: mijn vast staal moet worden opgelost in een bepaald solvent. Dus dan zit er in mijn blanco enkel het solvent en geen staal. Waarom eigenlijk? Omdat het solvent zelf ook absorbeert en dit willen we niet zien. We willen enkel de absorptie van ons te onderzoeken staal. Dus wordt de absorbantie van het solvent van de totale absorbantie van het cuvet met staal afgetrokken. Voor de liefhebbers hier is een schema van zulks toestel, klikkerdeklik hier.

In mijn techniek wordt elke golflengte van 500 tot 260 nm afgegaan om te zien bij welke golflengte de gastheer (staal) het meest absorbeert. Dit geeft dan een uniek spectrum met een bulten en putten. (zie volle groene lijn op figuur 2)

Om de bindingssterkte van de gastheer te bepalen met een bepaalde gast worden er steeds kleine hoeveelheden van deze gast toegevoegd. Indien de gast bindt met de gastheer vormt hij een nieuw molecuul met opzich weer een uniek absorptie spectrum. In mijn geval is dit een complex vorming. Indien het complex een 1:1 binding aangaat (dus 1 gastheer bindt met 1 gast) zal bij het toevoegen van een equivalente hoeveelheid gast als gastheer de absorbantie maximaal zijn (zie gestreepte groene lijn). In meeste gevallen is de binding sterk genoeg en zal na het toevoegen van meerdere equivalenten geen stijging in absorbantie meer voorkomen. Hieronder heb ik een voorbeeld geschetst voor jullie. Visueel is alles altijd beter :P 

 Wanneer het bindingsevenwicht nog niet bereikt is door onvoldoende gast zal een tussen vorm voorkomen (zie grijze lijnen). Dit soort verandering in absorbantie noemt met een shift. (In NMR wordt deze term ook rijkelijk gebruikt).

Wat was nu juist het probleem? Juist ja, dat ook nog :P

Wel uit mijn waardes bleek het complexvorming niet zo te verlopen zoals verwacht. Na wat nadenken kwamen we (mentor en ik) op het idee om een Job plot uit te voeren (genoemd naar de uitvinder). Dit zou achterhalen wat voor soort complexvorming er plaatsvindt. (3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, ....) 

Omdat we met wat problemen zaten over de methode zelf dachten we ook ineens een verdunningsreeks te doen. Het Job plot gaf het correct antwoord maar toch nog steeds iets vreemds. 

De verdunningsreeks gaf ook vreemde waarden, heel vreemde waarden. 

Normaal gezien zou bij een verdunning de absorbantie moeten dalen, zoals de wet van Lambert-Beer ons verteld. 

A = C x ԑ x d

A: absorbantie (eenheidsloos)

C: concentratie (mol/L)

ԑ: absorbantie- of exctinctiecoëfficiënt (L/(mol cm))

d: de weglengte door het cuvet (meestal 1 cm)

Een geleidelijke daling in absorbtie door verdunning van de concentratie. Spijtig genoeg kreeg ik niet zo'n mooi spectrum. Maar bij de verdunning kreeg ik een shift zoals te zien in figuur 2. Niet helemaal hetzelfde maar ongeveer. Het was het rechtse spectrum tot op het voorlaatste moment en dan sprong het naar het origineel spectrum (begrijp je?). Dit is natuurlijk niet goed. 

De mentor en ik konden eerst geen verklaring vinden voor het fenomeen tot we op het idee kwamen van zelf associatie. Indien de gastheer met zichzelf zou binden zou dit zorgen voor een ander molecuul dus een ander spectrum. Dus de volgende dag probeerde ik een paar tests om te zien wanneer de geleidelijke overgang is tussen vrij molecuul en de zelf associatie. Uit deze test kwam gewoon hetzelfde resultaat. Tot op het voorlaatste moment was het het rechtse spectrum en dan plots *poof* stond hij links voor het origineel (100% gastheer) spectrum. Het maakte niet uit hoe klein de verdunning ook was. (zelfs bij 1% verdunning)

Wat kan het solvent, hoe minimaal mogelijk, nu doen aan een staal dat zelf is opgelost in hetzelfde solvent? We waren radeloos. Geen flauw idee. We waren al over de stappen heen gegaan, om te zien of ik iets fout deed, om te zien of ik wel steriele pipettentips en pasteur pipetjes gebruikte, enz. Niets leek logisch en ik deed niets fout. 

Tijdens de busrit terug naar huis met de mentor kwamen we op een andere theorie. Dat het misschien iets kinetisch was. Omdat het solvent de mogelijk heeft om de gastheer te deprotoneren kan dit leiden tot een nieuw molecuul met uiteraard weer zijn eigen uniek absorptie spectrum. Maar dat het dan na een tijdje de protonen terug geeft, eens het equilibrium (evenwicht) gevormd is. Dus kinetisch, beweging, interactie, ... . 

De volgende dag ik met volle moed terug aan het werk om onze theorie te gronden. Eeeuh ja... ik moet niet veel meer zeggen zeker. 

Het mysterie doolde verder in ons hoofd terwijl ik de rest van mijn UV titraties afmaakte. "Er is geen logische verklaring voor." Mijn mentor is een post doc. Dus hij heeft 2 doctoraten. Als hij het niet ziet moet het wel iets vreemd zijn. Misschien zelfs iets nieuw?

Vorige week vrijdag moest ik de allerlaatste titraties doen, maar fijn was anders. Mijn resultaten waren enorm vreemd en het was gewoon afschuwelijk om te zien. 

Geen uitleg voor, radeloos...

Mijn mentor kwam toevallig langs en keek met vreemde ogen naar mij, ik vertelde hem, "het is nog erger dan ervoor met deze gast. Ik heb de concentratie al moeten aanpassen om iets meetbaars te kunnen krijgen maar het lukt niet." Hij wist niet wat zeggen. Sprakeloos...

Tijd om uit de doos te denken.

Ik kwam met absurde ideeën af en mijn mentor sprak eerst "tegen" en op het einde van het gesprek zag hij mijn ideeën wel als goed (grappig om te zien). We hadden niets te verliezen (dachten we). 

Vorige week vrijdag heb ik dan uiteindelijk het mysterie kunnen oplossen. Alhoewel het goed is was het eigenlijk geen goed nieuws. 

Uit mijn resultaten blijkt dat het glazen pasteur pipetjes die ik gebruik om mijn stoffen te mixen in mijn cuvet gecontamineerd is met iets. Zelfs vers uit de doos. Met andere woorden al mijn UV titraties zijn plots onbetrouwbare waarden geworden. Dit is niet echt iets dat je wil net voor je laatste week van je stage.

Ik zal gerust al even wat vragen beantwoorden:

Gevolg?

B. moet proberen al zijn UV titraties (35) opnieuw te doen in 1 week tijd.

Wat had B. origineel gepland?

Dit was geen labo week maar een schrijf week omdat de thesis niet vorderde tijdens het labwerk. 

Hoe gaat het met B.?

Mentaal eronderdoor, dit weekend heeft hij niet veel geslapen, hij is uitgeput en de week is nog maar net begonnen. 

Vandaag heeft hij meer dan 6u aan een stuk door gewerkt aan zijn UV titraties, heeft geen tea-time kunnen nemen in de ochtend en heeft geen lunch pauze genomen in de middag. Had gedaan met werken tegen dat de werkuren om waren, heeft dan zijn lunch gegeten en is naar huis vertrokken. 

Hoe ziet de toekomst er uit voor B.?

Labowerk overdag en schrijven 'snachts. *zucht*

Wanneer schreef B. dit?

over het weekend verspreid.

Waarom?

omdat hij anders zot werd.

Heeft hij ook nog genoten dit weekend?

Ja vrijdag zijn we gaan paintballen, daar heb ik op een tactische manier mijn frustratie deels kunnen weg schieten. En ja hoor ons team heeft geowned! We hebben er wel wat letsels aan over gehouden maar het was het waard. Diezelfde avond heb ik dan ook voor de allereerste keer gesnookerd en afscheid genomen van L. omdat haar stage ten einde is gelopen. 

Ik hoop dat het interessant en duidelijk was. Ik heb geprobeerd om zo weinig mogelijk over mijn stage zelf te praten vermits het beroepsgeheim is. En natuurlijk heb ik ook niet alles verteld want dat zou de zaken alleen maar ingewikkelder maken voor de niet chemici onder ons.

Ik zou wel willen groetjes geven maar daar ben ik te moe voor. 

Bedankt om het te lezen

B. vanuit Ierland